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細(xì)胞培養(yǎng)相位差顯微鏡,細(xì)胞計(jì)數(shù)器,細(xì)胞培養(yǎng)箱廠商
材料：
A549 細(xì)胞株 (肺泡上皮細(xì)胞)
培養(yǎng)基：A549 培養(yǎng)基
F12K medium (Gibco Life) 500ml
胎牛血清
50ml
盤(pán)尼xi林/鏈霉素
5ml
清洗液：PBS (Phosphate buffered saline) 1X 溶液
蛋白質(zhì)溶解液：Trypsin 0.5%
染料：trypan blue 0.04% (Gibco Life)
T75 培養(yǎng)瓶
儀器：
細(xì)胞計(jì)數(shù)器
相位差顯微鏡
細(xì)胞培養(yǎng)箱
方法：
1.將冷凍管置于 37℃水浴中迅速解凍后，以 70%酒精擦拭管壁及管口，在
無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)用無(wú)菌吸管將細(xì)胞溶液放入 5—10ml 溫?zé)崤囵B(yǎng)基，離心
1000rpm 5 分鐘，以去除冷凍保存劑 (DMSO)。
2.移去上清液，加入新鮮培養(yǎng)基，將細(xì)胞均勻混合于培養(yǎng)基中，移入 T75
flask。
3.放入培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。(培養(yǎng)條件：37℃、5%CO2、濕度)
4.在解凍培養(yǎng)后 24 小時(shí)內(nèi)更換培養(yǎng)基。
5.培養(yǎng) 3-4 天需更換培養(yǎng)基。
6.當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)培養(yǎng)瓶時(shí)，需進(jìn)行繼代培養(yǎng)。
7.移去 A549 培養(yǎng)基，加入 10ml PBS 緩衝液洗滌細(xì)胞 2 次后移去。
8.加入 0.5ml 5% trypsin，使其能 rinse 所有細(xì)胞，之后放入培養(yǎng)箱內(nèi)作用 3分鐘。
9.拿出后拍打培養(yǎng)瓶使細(xì)胞自瓶壁脫落，加入 10ml 新鮮培養(yǎng)基，均勻混合
后轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)瓶中。
10.取 10μl 細(xì)胞懸浮液和 10μl 0.04% trypan bule，混合均勻，滴入計(jì)數(shù)片
中，計(jì)算角落四格之細(xì)胞數(shù)，帶入以下公式，即可算出細(xì)胞數(shù)
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